OBIETTIVI E CONTENUTI

OBIETTIVI FORMATIVI

Lo scopo del corso è quello di fornire agli studenti conoscenze teoriche, ma anche pratiche sui presupposti e le tecniche alla base dell’ingegneria delle proteine e degli anticorpi. Inoltre, una parte del corso sarà dedicata anche all’approfondimento delle tecniche di sintesi chimica delle proteine. Per quanto riguarda il modulo di Ingegneria proteica, verranno inizialmente ripresi ed ampliati alcuni concettivi base relativi alla produzione di proteine ricombinanti. Quindi, verranno analizzati i diversi approcci per ottenere proteine modificate o ottimizzate per le diverse applicazioni , le tecniche impiegate e i sistemi di selezione/screening, utilizzando anche esempi dalla letteratura o impiegati a fini produttivi/commerciali. Nella sezione del corso riguardante l’ingegneria degli anticorpi verranno forniti elementi sulla struttura tridimensionale delle immunoglobuline e successivamente saranno affrontate, seguendo l’ordine cronologico di realizzazione, le diverse tecniche di umanizzazione, di produzione ricombinante e di phage display degli anticorpi. Nel modulo di Ingegneria chimica verranno esaminate le principali tecniche per la sintesi chimica di peptidi e proteine e le applicazioni derivanti da queste tecniche.

MODALITA' DIDATTICHE

Lezioni frontali.

PROGRAMMA/CONTENUTO

Il corso è composto da 3 moduli. Per ciascun modulo, ogni argomento corrisponde a circa 2 ore di lezione

Modulo 1: Ingegneria proteica (Prof. Michela Tonetti)

• Proteine ricombinanti:  sistemi di espressione procariotici, eucariotici e in vitro, vantaggi e svantaggi. Sistemi di espressione in procarioti: caratteristiche dei più comuni vettori procariotici e dei ceppi batterici per la produzione.
• Sistemi di espressione in procarioti: produzione di proteine tossiche o insolubili, espressione periplasmica, secrezione, espressione di proteine di membrana.
• Sistemi di espressione in eucarioti: lieviti, cellule di insetto e di mammifero. Caratteristiche dei vettori di espressione eucariotici.
• Sistemi di espressione “cell-free”. Esempi di tecniche
• Proteine ricombinanti: ottimizzazione della produzione, controllo di qualità delle proteine ricombinanti, purificazione ed uso delle proteine dai corpi di inclusione, proteine glicosilate.
• Ingegneria proteica: concetti generali, il “sequence space”, i diversi tipi di approccio (de novo design, rational design, directed evolution, computational design). Estensione del codice genetico,  uso di amminoacidi non naturali.
• Rational design: principi e principali metodi. Mutagenesi sito specifica, domain swapping e chimeragenesi, saturation mutagenesis. Esempi dalla letteratura.
• Il rational design nello studio di proteine. Esempi di proteine terapeutiche modificate mediante approcci di tipo razionale (muteine dell’insulina, darbepoetin, etanercept), pegilazione ed altre modifiche covalenti.
• Directed evolution: principi, creazione delle library e selezione/screening dei mutanti. Principali tecniche impiegate: error prone PCR e metodi di shuffling.
• Directed evolution: DNA shuffling e tecniche derivate, StEP, synthetic shuffling, directed evolution e computational design, approcci combinati. Esempi pratici di applicazione della directed evolution: resistenza al glifosato (Roundup), ottimizzazione di enzimi per applicazioni industriali.
• La selezione e lo screening dei mutanti ottenuti mediante tecniche di directed evolution. Le tecniche di display: phage, bacterial e yeast display. Ribosome e mRNA display
• La GFP come esempio di proteina mutagenizzata mediante approcci combinati. Effetti delle mutazioni sulle caratteristiche spettrali, correlazioni tra struttura e spettri.

Modulo 2: Ingegneria degli anticorpi (Prof. Fabio Ghiotto)

• La struttura delle immunoglobuline, il dominio immunoglobulinico, regioni CDR e FR, l’antigen binding site, la regione costante delle immunoglobuline, cenni sulla genetica delle immunoglobuline.
• Cenni sull’uso terapeutico degli anticorpi. Gli anticorpi monoclonali, gli anticorpi chimerici, tecniche di umanizzazione degli anticorpi: CDR/SR grafting, resurfacing, superhumanization. Produzione di anticorpi umani in topi transgenici. Immunogenicità degli anticorpi a scopo terapeutico.
• Anticorpi in formati alternativi: frammenti scFv, proteine di fusione scFV-Fc, piattaforme di display anticorpale, anticorpi ricombinanti derivanti da camelidi (nanobodies).
• Espressione di anticorpi in vitro.
• Utilizzo di anticorpi ricombinanti in terapie anti-tumorali e in tecniche di imaging.

Modulo 3: Ingegneria Chimica (Prof Enrico Millo)

• IL LEGAME PEPTIDICO E SUA FORMAZIONE
• SINTESI DI PEPTIDI  IN FASE LIQUIDA
• SINTESI DI PEPTIDI IN FASE SOLIDA

• strategie di sintesi tradizionali
• sintesi convergenti

• SINTESI DI PROTEINE CON METODICHE CHIMICHE (PEPTIDE LIGATION)

• chemical ligation
• native chemical ligation
• expressed protein ligation

• STRATEGIE  DI SINTESI  PER PROTEINE  TRADIZIONALI E MODIFICATE
• ESEMPI DI SINTESI CHIMICA DI PROTEINE

TESTI/BIBLIOGRAFIA

Non sono al momento disponibili testi adeguati. Oltre agli appunti delle lezioni, gli studenti avranno a disposizione del materiale didattico sotto forma di dispense e pubblicazioni dalla letteratura scientifica.

DOCENTI E COMMISSIONI

Commissione d'esame

MICHELA TONETTI (Presidente)

FABIO GIUSEPPE GHIOTTO

ENRICO MILLO

LEZIONI

INIZIO LEZIONI

1 Marzo 2017.

Orari delle lezioni

PROTEIN ENGINEERING

ESAMI

MODALITA' D'ESAME

Orale.

MODALITA' DI ACCERTAMENTO

L’accertamento del raggiungimento degli obiettivi formativi verrà  effettuato mediante esami orali. La data degli appelli verrà concordata con gli studenti.