OBIETTIVI FORMATIVI

Fare acquisire allo studente una conoscenza dettagliata dei sistemi di trasferimento genico attualmente in uso in terapia e le modalità con cui si è pervenuti al loro impiego, correlandoli con le conoscenze di fisiologia, biologia molecolare ed ingegneria genetica; fare acquisire una visione delle future possibilità di applicazione della terapia genica alla luce delle conoscenze attuali delle patologie monogeniche di maggiore incidenza.

OBIETTIVI FORMATIVI (DETTAGLIO) E RISULTATI DI APPRENDIMENTO

Al termine del corso lo studente dovrà essere edotto circa: a) principi di applicazione, metodologie e requisiti tecnici per la preparazione di prodotti per terapia genica; b) caratteristiche biologiche, morfologiche, genetiche e funzionali dei vettori virali impiegati in terapie avanzate; c) vantaggi, svantaggi, rischi delle applicazioni terapeutiche ad oggi in essere, anche in rapporto alle terapie di riferimento. Ci si attende che lo studente possa valutare comparativamente scelte terapeutiche differenti (farmacologiche tradizionali o avanzate) rispetto ad una specifica condizione patologica, supportando criticamente le proprie osservazioni.

MODALITA' DIDATTICHE

Il Corso si articola in 20 ore di lezione. Le ore di lezione si intendono come ore frontali durante le quali la materia è svolta mediante presentazioni tipo PowerPoint. Il docente renderà disponibile il materiale agli studenti. Durante il corso agli studenti verrà anche proposto di effettuare la presentazione in aula di una revisione critica di un articolo tratto da una rivista del settore; tale presentazione è facoltativa, ma può contribuire alla valutazione complessiva dello studente. Gli articoli verranno proposti dal docente ed assegnati durante la seconda metà del modulo. 

PROGRAMMA/CONTENUTO

I clinical trials basati su approcci di Terapia Genica: principi, esigenze ed ottimizzazioni

-Clinical trials basati sull’attuale terapia genica: distribuzione geografica, aspetti socio-economici e di sviluppo della tecnologia sanitaria; -Le basi applicative della terapia genica: principi essenziali e scelta del target terapeutico; criteri di applicabilità; -Esempi di applicazione della terapia genica: trattamento di patologie quali la sindrome da deficienza di Adenosina deaminasi (ADA), la sindrome da immunodeficienza multipla grave (SCID e X-SCID) e l’epidermolisi bollosa giunzionale (JEB): risultati delle terapie e complicazioni da esse derivate.

I vettori virali utilizzati in Terapia Genica: strutture, caratteristiche, impieghi, vantaggi e svantaggi

Herpesviridae: -I virus della famiglia Herpesviridae: caratteristiche strutturali del capside, delle proteine della matrice e dell’envelope virale; -Struttura e caratteristiche funzionali del genoma virale: geni immediate-early (IE),early (E) e late (L); -Caratteristiche e funzioni delle proteine virali;-Il ciclo vitale degli Herpesviridae: ciclo litico e ciclo lisogenico; -Tropismo e specificità dei virioni; -Sistemi di packaging basati sull’impiego di virus helper; -Sistemi di packaging helper virus-free; -Inserimento di transgeni nel vettore virale HSV; -Ottimizzazione del vettore virale per sottotipi di cellule target: la funzione delle proteine gB e gD; -Sindbin Virus e Semliki Forest Viruses (SFV): loro impiego come vettori suicidi.

Adenoviridae: -Struttura del capside degli Adenoviridae; -Struttura e funzioni del genoma degli Adenoviridae; -Geni E1, E2, E3 ed E4; -ITR e regione psi (ψ); -Effetti degli Adenoviridae e proteine coinvolte nella protezione del virione ai danni dell’ospite; -Rischi associati all’uso dei vettori adenovirali in terapia genica; -Potenziamento dei vettori adenovirali mediante ingegnerizzazione delle proteine del capside (es. RGB); mediante attività promotore-specifica (promotori di tessuti tumorali); mediante “pro-drug enzymes”; mediante “vector-spread molecules”; mediante molecole anti-tumorali; -Studi pre-clinici: aspetti positivi e negativi dei risultati condotti su modelli murini; -Virus Adeno-associati (AAV): struttura del genoma virale e sua replica; -Esigenze della fase di packaging e del virus helper.

Retroviridae: -Struttura della famiglia dei Retroviridae: la particella virionica; -Struttura e forma del virione; forma integrata; -Struttura e caratteristiche rilevanti del genoma retrovirale; -I geni ed i prodotti proteici codificati dal genoma retrovirale; -Meccanismo di replica del genoma retrovirale: generazione e duplicazione delle LTR nella forma integrata. -Generazione di virus helper per linee di packaging di vettori retro virali: strategie e vantaggi; -Vettori con minigene in “doppia copia”; -Linee di packaging per vettori retro virali: caratteristiche e vantaggi e svantaggi; -Linee di packaging con virus helper bi- e tri-partiti; -Implementazione del tropismo virale dei Retroviridae: strategie utilizzate; -Proteine accessorie dei Lentiviridae e comparazione con i Retroviridae: struttura, codifica e funzioni di Tet, Rev, Vif, Vpi, Vpx, Vpu e Nef; sequenze SMARs. -Ottimizzazione dei vettori lenti virali e problematiche connesse alle linee di packaging; -Efficacia dei vettori “self-inactivating” (SIN) e dei vettori Integrasi-mutati.

 -Metodi di recupero dei virioni LV: ultracentrifugazione, precipitazione con poli-lisina, cromatografia a scambio ionico; -Comparazione tra HSV, AV, AAV, Retrovirus e LV; -Utilizzo di LV per il trasferimento terapeutico di shRNA.

Approcci di Terapia Genica mediante vettori non-virali: -Trasferimento genico mediante vettori non-virali; -Sistemi di iniezione di DNA nudo mediante inoculo; jet-gas; gene gun, elettroporazione, sonoporazione, trasferimento idrodinamico, vettori chimici; -Esempi terapeutici: caratteristiche del tessuto bersaglio degli approcci di terapia genica mediante vettori non virali.

Applicazioni cliniche della Terapia Genica: -nelle cellule staminali ematopoietiche; -nelle distrofie muscolari;-nell’emofilia;- nella cura dei tumori; - nel trattamento delle patologie neurodegenerative

TESTI/BIBLIOGRAFIA

M. Giacca; “Terapia Genica”; Springer Biomed Eds., 2011

A.J. Dunn; “Elementi di virologia molecolare”; CEA Eds.

B. Alberts,et al; “Biologia molecolare della cellula”; Zanichelli Eds.

J.D. Watson, et al.: “DNA Ricombinante”; Zanichelli Eds.