OBIETTIVI FORMATIVI

Il corso fornisce agli studenti la descrizione delle procedure di laboratorio e degli strumenti più utilizzati in un moderno laboratorio di Biochimica, vertendo sui seguenti argomenti: tecniche per la produzione di colture cellulari; tecniche per lo studio e la manipolazione del DNA; tecniche per la purificazione e lo studio delle proteine, con particolare riferimento alle tecniche cromatografiche ed elettroforetiche.

MODALITA' DIDATTICHE

Il Corso si articola in  lezioni frontali in aula.

Le lezioni sono sviluppate con il supporto di materiale informatico e, per quanto possibile, organizzate dando spazio alla modalità partecipativa.

 Materiali di supporto e di approfondimento (presentazioni ppt, articoli, link a siti di interesse, bibliografia,  ecc.) saranno resi disponibili su aulaweb.

PROGRAMMA/CONTENUTO

Biochimica Applicata- (5 CFU) Programma
 

Soluzioni-tampone e pH: scelta dei tamponi per uso biochimico.
Colture cellulari.

Campioni biologici. Omogenizzazione: scelta delle metodiche e dei media.

Tecniche centrifugative: principii, velocità angolare, rpm, RCF, coefficiente di sedimentazione. Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari. Centrifugazione su gradiente di densità.

Tecniche spettroscopiche: Spettrofotometria UV/VIS. Legge di Lambert-Beer. Determinazione della concentrazione delle proteine mediante metodo di Bradford. Spettri di assorbimento del NADH/NADPH. Dosaggio dell'attività enzimatica dei principali enzimi di interesse clinico: LDH, CK, succinico DH. Spettrofluorimetria (principi generali e applicazioni) e Luminometria. Cenno alla citofluorimetria a flusso e “cell sorting”.

Tecniche cromatografiche: principi generali ed applicazioni: metodiche analitiche e preparative. Risoluzione e piatti teorici. Tipi di cromatografia su colonna a bassa pressione: a scambio ionico, ad esclusione (gel filtrazione). Cromatografia di affinità. E immunoaffinità.  Cenno alla HPLC.

Tecniche elettroforetiche: principi generali. Apparecchi per i diversi supporti (acetato di cellulosa, Agarosio, poliacrilamide). Elettroforesi di proteine su gel di poliacrilamide in condizioni native e in presenza di sodio-dodecil-solfato (SDS-PAGE). Determinazione del PM delle proteine. Western blotting nello studio delle proteine.
Metodiche di colorazione delle proteine su gel e nitrocellulosa.

Tecniche di purificazione di proteine. Protocolli di purificazione. Attività specifica. Precipitazione frazionata di proteine: con solfato d'ammonio (salting-out); al calore. Sequenziamento di Edman. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii.

Tecniche elettrochimiche. Elettrodo ad ossigeno; esempi di studi di consumo di Ossigeno.
Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione di misura della radioattività. Cenno ai tipi di decadimento radioattivo. Autoradiografia. Cenno alle applicazioni dei radioisotopi in biochimica: studio di vie metaboliche.
Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi. Anticorpi policlonali (antisieri) e monoclonali. Immunoprecipitazione. RIA; dosaggi immunoenzimatici: ELISA.
Tecniche proteomiche e Spettrometria di Massa. Proteomica e Metabolomica. Isoelettrofocalizzazione (IEF) e determinazione del punto isoelettrico delle proteine. Elettroforesi bidimensionale (2-DE). Rivelazione colorimetrica mediante Coomassie Brillant Blue e Blue silver. Cenno al sequenziamento delle proteine  mediante spettrometria di massa.
Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Sequenzamento del DNA. Identificazione di sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione (Southern blotting e Northern blotting).  Tecnica CRISPR_Cas9.

TESTI/BIBLIOGRAFIA

Testo di riferimento:

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo, “Metodologie Biochimiche”. Casa Ed. Zanichelli, 2019

Altri testi di consultazione:

M. Stoppini, V. Bellotti. Biochimica applicata EdiSES  2012

C. De Marco, C. Cini, “Principi di metodologia Biochimica” ed. Piccin, Padova, 2009