OBIETTIVI FORMATIVI

Il corso fornisce agli studenti la descrizione delle procedure di laboratorio e degli strumenti più utilizzati in un moderno laboratorio di Biochimica, vertendo sui seguenti argomenti: tecniche per la produzione di colture cellulari; tecniche per lo studio e la manipolazione del DNA; tecniche per la purificazione e lo studio delle proteine, con particolare riferimento alle tecniche cromatografiche ed elettroforetiche.

OBIETTIVI FORMATIVI (DETTAGLIO) E RISULTATI DI APPRENDIMENTO

Scopo dell'insegnamento è fornire agli studenti le nozioni di base della biochimica  cellulare, delle macromolecole e degli enzimi, con un approccio analitico alle  principali tecniche di biochimica e biologia molecolare in uso nei laboratori di ricerca sia di base sia applicata. Le metodologie biochimiche più moderne sono presentate e discusse  criticamente con l' obiettivo formativo  di forinire la conoscenza delle tecniche utili nella separazione, identificazione e analisi delle biomolecole per applicazioni di ricerca, e applicative. I contenuti del corso sono costantemente aggiornati.

I risulatti di apprendimento che l'esame degli studenti da parte del docente  valuterà sarà la adeguata  conoscenza e comprensione  delle tecniche biochimiche esposte. 

MODALITA' DIDATTICHE

Il Corso si articola in  lezioni frontali in aula.  La didattica frontale e gli esami potranno essere svolti a distanza in modalità telematica.

Le lezioni sono sviluppate con il supporto di materiale informatico e, per quanto possibile, organizzate dando spazio alla modalità partecipativa.

 Materiali di supporto e di approfondimento (presentazioni ppt, articoli, link a siti di interesse, bibliografia,  ecc.) saranno resi disponibili su aulaweb.

PROGRAMMA/CONTENUTO

Biochimica Applicata- (5 CFU) Programma
 

Soluzioni-tampone e pH: scelta dei tamponi per uso biochimico.
Colture cellulari. 

Campioni biologici. Omogenizzazione: scelta delle metodiche e dei media.

Tecniche centrifugative: principii, velocità angolare, rpm, RCF, coefficiente di sedimentazione. Centrifughe e rotori. Centrifugazione differenziale: separazione e analisi di frazioni subcellulari. Centrifugazione su gradiente di densità.

Tecniche spettroscopiche: Spettrofotometria UV/VIS. Legge di Lambert-Beer. Determinazione della concentrazione delle proteine mediante metodo di Bradford. Spettri di assorbimento del NADH/NADPH. Dosaggio dell'attività enzimatica dei principali enzimi di interesse clinico: LDH, CK, succinico DH. Spettrofluorimetria (principi generali e applicazioni) e Luminometria. Saggio del contentuto di ATP con il metodo Luciferina/Luciferasi.  Cenno alla citofluorimetria a flusso e “cell sorting”.

Tecniche cromatografiche: principi generali ed applicazioni: metodiche analitiche e preparative. Risoluzione e piatti teorici. Tipi di cromatografia su colonna a bassa pressione: a scambio ionico, ad esclusione (gel filtrazione). Cromatografia di affinità. E immunoaffinità.  Cenno alla HPLC.

Tecniche elettroforetiche: principi generali. Apparecchi per i diversi supporti (acetato di cellulosa, Agarosio, poliacrilamide). Elettroforesi di proteine su gel di poliacrilamide in condizioni native e in presenza di sodio-dodecil-solfato (SDS-PAGE). Determinazione del PM delle proteine. Western blotting nello studio delle proteine.
Metodiche di colorazione delle proteine su gel e nitrocellulosa.

Tecniche di purificazione di proteine. Protocolli di purificazione. Attività specifica. Precipitazione frazionata di proteine: con solfato d'ammonio (salting-out); al calore. Sequenziamento di Edman. Dialisi ed ultrafiltrazione: principii.

Tecniche elettrochimiche. Ossimetria; Elettrodo ad ossigeno; esempi di studi di consumo di Ossigeno.
Metodi radioisotopici. Principi, strumentazione di misura della radioattività. Cenno ai tipi di decadimento radioattivo. Autoradiografia. Cenno alle applicazioni dei radioisotopi in biochimica: studio di vie metaboliche.RIA.
Tecniche immunochimiche. Struttura degli anticorpi. Anticorpi policlonali (antisieri) e monoclonali. Immunoprecipitazione. RIA; dosaggi immunoenzimatici: ELISA.
Tecniche proteomiche e Spettrometria di Massa. Proteomica e Metabolomica. Isoelettrofocalizzazione (IEF) e determinazione del punto isoelettrico delle proteine. Elettroforesi bidimensionale (2-DE). Rivelazione colorimetrica mediante Coomassie Brillant Blue e Blue silver. Cenno al sequenziamento delle proteine  mediante spettrometria di massa e ai più moderini spettromerti quli il quadrupolo.
Tecniche di biologia molecolare. Tecnologia del DNA ricombinante: principi generali. Sequenzamento del DNA. Identificazione di sequenze di DNA ed RNA: ibridizzazione (Southern blotting e Northern blotting).  cenno alla Tecnica CRISPR_Cas9.

TESTI/BIBLIOGRAFIA

Testo di riferimento:

M.C. Bonaccorsi di Patti, R. Contestabile, M.L. Di Salvo, “Metodologie Biochimiche”. Casa Ed. Zanichelli, 2019

Altri testi di consultazione:

M. Stoppini, V. Bellotti. Biochimica applicata EdiSES  2012

C. De Marco, C. Cini, “Principi di metodologia Biochimica” ed. Piccin, Padova, 2009