OBIETTIVI FORMATIVI

Acquisire le conoscenza e le competenze relative a: i) i principali meccanismi molecolari alla base della gestione dell’informazione all’interno della cellula procariotica ed eucariotica; ii) le basi strutturali delle molecole coinvolte nei processi informativi della cellula; iii) le principali tecnologie in uso per lo studio molecolare dei genomi e del materiale genetico.

OBIETTIVI FORMATIVI (DETTAGLIO) E RISULTATI DI APPRENDIMENTO

L'insegnamento ha la specifica finalità di permettere allo studente di acquisire le conoscenze di base su quanto di pertinenza della disciplina. All'acquisizione dei crediti previsti, esso dovrà dimostrare di avere nel proprio bagaglio culturale una conoscenza approfondita dei meccanismi che sono alla base dei processi di replicazione, trascrizione e traduzione dell'informazione genetica, nonché informazioni dettagliate sull'organizzazione strutturale degli acidi nucleici, sui meccanismi di ricombinazione e trasposizione e sulle molteplici funzioni dell'RNA. Dovrà altresì possedere una chiara ed approfondita conoscenza del ruolo del codice genetico quale sistema universale di gestione dell'informazione negli esseri viventi.

L'insegnamento inoltre permetterà di acquisire le informazioni relative a quelle che sono le principali tecniche ad oggi utilizzate per lo studio del genoma, quali PCR e PCR quantitativa, sequenziamento degli acidi nucleici e DNA chip e loro relative applicazioni nei vari ambiti professionali (ricerca, diagnostica medica, medicina forense, monitoraggio della qualità ambientale e alimentare) oltre alle tecniche di base per la realizzazione di genoteche, cDNA library e le principali tecniche di gestione del DNA ricombinante

L'attività pratica prevista inoltre renderà lo studente capace di gestire autonomamente le principali tecniche di laboratorio oggi impiegate per l'estrazione e l'analisi elettroforetica del DNA, per l'ottenimento di cDNA da messaggeri estratti da cellule eucariotiche, per la loro amplificazione a mezzo PCR e per la successiva analisi elettroforetica dei risultati.

PREREQUISITI

Per affrontare in maniera efficace lo studio della biologia molecolare è necessario avere acquisito le conoscenze della chimica generale ed inorganica (in particolare ampia padronanza dei concetti base termodinamica chimica, equilibri chimici, pH), della chimica organica (in particolare acquisita conoscenza delle principali classi di molecole organiche e approfondita conoscenza delle quattro classi di macromolecole biologiche) e della biochimica (in particolare è richiesta una approfondita conoscenza della struttura delle proteine, del concetto di catalisi enzimatica, dei principali processi del metabolismo energetico).

MODALITA' DIDATTICHE

Lezioni frontali

Esercitazioni in laboratorio

PROGRAMMA/CONTENUTO

Lezioni frontali (8 CFU):

Struttura del DNA. Concetto di gene.
Cromatina ed istoni, il nucleosoma e le topoisomerasi
Meccanismi molecolari di replicazione del DNA in procarioti ed eucarioti. Le DNA polimerasi di procarioti ed eucarioti (struttura, funzioni, attività nucleasiche), la DNA primasi, l’elicasi. Il controllo della fedeltà della replicazione.
I frammenti di Okazaki, l’RNAsi H; la DNA ligasi. I meccanismi di inizio della replicazione in procarioti ed eucarioti, la DNAA, il Replicatore, l’iniziatore, il ruolo delle CDk nel controllo dell’inizio della replicazione.
Il termine della replicazione in procarioti ed eucarioti; la topoisomerasi nei batteri e la telomerasi negli eucarioti.
La trascrizione nei procarioti e negli eucarioti: i promotori; i fattori di trascrizione nei batteri; le RNA polimerasi di procarioti ed eucarioti; il moderatore; la terminazione della trascrizione; la gestione complessiva della trascrizione negli esseri viventi.
La maturazione del messaggero negli eucarioti; il capping in 5’, la poliadenilazione; l’autosplicing degli introni di tipo I e II; lo splicing gestito dallo spliceosoma; lo splicing alternativo
L’rRNA; la sintesi del tRNA. La sintesi dell’aminoacil tRNA e le aminoacil tRNA sintetasi.
Il codice genetico.
La traduzione in procarioti ed eucarioti.
La regolazione post-trascrizionale dell’espressione genica, gli RNA regolatori in batteri; i riboswitch, l’RNAi, le basi molecolari dell’RNA interference; i micro RNA.
La ricombinazione sito specifica e le ricombinasi. La ricombinazione VDJ.
La ricombinazione omologa.
I trasposoni a DNA.
I retrotrasposoni. I SINES e la dimostrazione della loro origine da retrotrasposoni.

Tecniche di estrazione degli acidi nucleici dai differenti campioni biologici.

Tecniche di analisi qualitativa e quantitativa degli acidi nucleici. Elettroforesi su gel di agarosio e in micro-fluidica. Dosaggi spettrofotometrici e fluorimetrici.

Reazione a catena della polimerasi (PCR) principio e applicazioni, software per il disegno dei primers e l’analisi strutturale degli ampliconi. Esercitazioni pratiche con Socrative.  

Applicazioni speciali della PCR. La retrotrascrizione dell’RNA, il cDNA e le tecniche RACE. Mutagenesi sito-specifica.

La PCR quantitativa (qPCR) e la digital PCR (ddPCR) principi e applicazioni i software per il disegno dei primers e le sonde.

Enzimi di restrizione e mappe di restrizione, software per ricerca enzimi. Esercitazioni pratiche con Socrative.

Realizzazione di DNA ricombinante. Vettori e Clonaggio genico. Realizzazione di ribosonde per ibridazione in situ.

Tecniche di sequenziamento del DNA. Metodo chimico Metodo enzimatico di Sanger

Tecniche di sequenziamento del DNA di nuova generazione (NGS). Metodo Illumina e metodo 454.

Elementi di bioinformatica per la biologia molecolare. I principali database di sequenze nucleotidiche e proteiche (NCBI, Bold, Swissprot). Il formato fasta e il PDB. Algoritmi per identificazione di sequenze, il sistema Blast (Blastn, Blatsp, tBlastx, tBlastn). (Esercitazioni pratiche con Socrative)

Elementi di bioinformatica per la biologia molecolare. Uso di software per allineamenti binari e multipli. Uso di software per predizione di modifiche post-traduzionali, esistenza di domini strutturali (SMART) e modeling molecolare. Esercitazioni pratiche con Socrative.

Il DNA ricombinante: principi di base, i vari vettori (plasmidi, fagi, cosmidi, BAC e YAC); le modalità di costruzione di una genoteca;
Il sequenziamento del genoma umano, tecniche e problematiche.
Il DNA satellite e suoi impieghi in genetica forense. Il test del DNA e il test di paternità.
Il DNA mitocondriale e il DNA dei cloroplasti: replicazione, caratteristiche funzionali e strutturali. L’impiego del DNA mitocondriale nello studio dell’evoluzione. Eva Mitocondriale. Y-Adam. L’impiego del DNA mitocondriale in genetica forense.
La biologia sintetica. La definizione di un genoma minimo batterico; la realizzazione del primo microrganismo artificiale.
L’approccio antisenso. Gli oligonucleoitidi antisenso; i PNA
La Xenobiologia: L’espansione del codice genetico. L’impiego del codone Amber per l’inserimento di aminoacidi non naturali nelle proteine; i tRNA ortogonali e relative sintetasi
I ribosomi ortogonali; la produzine di proteine aliene; gli XNA, il rapporto XNA-DNA

Parte pratica (1CFU):

Parte 1 in aula, al pc esercizi di bioinformatica

Es. 1 Ricerca primer per PCR

Es. 2 Ricerca enzima di restrizione

Es. 3 Ricerca sequenze geniche in database data an

Es. 4 Ricerca sequenze in Blast

Es. 5 Allineamenti binari e multipli

Parte2 in laboratorio

Estrazione DNA da vari campioni biologici (sedimento, lievito, cellule di mammifero, Batteri, Piante)

Preparazione di gel di agarosio

Allestimento di reazione di PCR

Dosaggio degli acidi nucleici

Digestione con enzimi di restrizione

Analisi elettroforetica

TESTI/BIBLIOGRAFIA

L'approfondimento individuale dei contenuti previsti dal programma potrà essere effettuato su qualunque testo universitario di biologia molecolare offerto dal mercato, purchè trattasi di edizioni aggiornate all'ultimo quinquennio.