OBIETTIVI FORMATIVI

Il Corso si propone di fornire le conoscenze di base di una tecnica di ampia diffusione. In particolare, il raggiungimento dei seguenti obiettivi: conoscenza dei principi fondamentali della citometria a flusso e della strumentazione; punti di riferimento e linee guida nell’esecuzione di misure citometriche; approfondimento di applicazioni per studi in campo biologico e medico; lettura ed interpretazione dei risultati ottenuti.

OBIETTIVI FORMATIVI (DETTAGLIO) E RISULTATI DI APPRENDIMENTO

La frequenza e la partecipazione alle attività formative (lezioni frontali e frequenza in laboratorio) consentiranno allo studente di acquisire le conoscenze necessarie per affrontare le diverse tipologie ed approcci che applicano misure citometriche in campo biologico. 
Nello specifico  il Corso si propone il raggiungimento dei seguenti obiettivi: 
- conoscenza dei principi fondamentali  della citometria a flusso e della strumentazione; - punti di riferimento e linee guida nell’esecuzione di misure citometriche; - approfondimento di applicazioni per studi in campo biologico ; - lettura ed interpretazione dei risultati ottenuti. 

PREREQUISITI

Per affrontare efficacemente i contenuti dell’insegnamento sono necessarie le seguenti conoscenze di base: struttura della cellula e dei suoi componenti, conoscenza del ciclo cellulare, nozioni generali dell’interazione luce-materia e del  fenomeno della fluorescenza.

MODALITA' DIDATTICHE

L’insegnamento prevede 40 ore tra lezioni frontali erogate mediante presentazioni multimediali e presentazione di files citometrici  e laboratori con esempi di acquisizioni/ analisi e sorting. 

PROGRAMMA/CONTENUTO

1.     La Citofluorimetria:

·        Significato /bibliografia consigliata

·        Storia della tecnologia

2.     La Fluorescenza e i fluorocromi: principi e funzionamento, nozioni generali sui coloranti per gli acidi nucleici, per le proteine

3.     La fluidica: principi di idrodinamica applicati

4.     L’ottica: luce, teoria e materiali

5.     L’elettronica: acquisizione, analisi e rappresentazione dei dati

1. Procedure della performance strumentale: controllo della strumentazione (calibrazione, taratura, linearità); impostazione della soglia di analisi, compensazione
2. Preparazione del campione: conoscenze di base per la preparazione dei campioni (campioni freschi, fissati o congelati); manipolazione di linee cellulari in coltura e loro preparazione per indagini citometriche (con particolare riferimento alle colture in adesione: distacco, fissazione, ecc); trattamento ed analisi di campioni (biopsie) di tessuti solidi con particolare riferimento alle varie tecniche di disaggregazione; studio di microvescicole. 

8.     La citofluorimetria multiparametrica:

·        Preparazione del campione ed allestimento del pannello

·        Problem solving: spill-over e compensazione

·        Autofluorescenza, quenching, bleaching

·        Setting degli anticorpi (staining index)

9.  Gestione ed Analisi dei dati generati: Concetti principali connessi con l’analisi di un file citometrico: nozioni sulle diverse modalità di gating; compensazione off-line delle fluorescenze; controllo isotipico ed isoclonico, fluorescence minus one (FMO); Criteri per la valutazione della positività; principali tipologie di rappresentazione dei dati citometrici.

10.  Il cell sorting: teoria e funzionamento strumentale, esempi di applicazioni

11.  Applicazioni della piattaforma citometrica in ricerca biomedica e in diagnostica:

·         valutazione del ciclo cellulare e della proliferazione cellulare;

·         valutazione dell’apoptosi, necrosi e morte cellulare;

·         studio di marcatori di superficie, intracitoplasmatici ed intranucleari;

·         cell signalling;

·         produzione di fattori solubili;

·         Citotossicità

·         Le microvescicole e gli esosomi

12.  Stato dell’arte e strumenti di nuova generazione.

TESTI/BIBLIOGRAFIA

STRUMENTI A SUPPORTO DELLA DIDATTICA: Tutte le slides utilizzate durante le lezioni  saranno disponibili su AulaWeb al termine del  ciclo di lezioni in formato PDF  insieme ad altro materiale bibliografico